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绝对定量
绝对定量是用已知的标准曲线推算出某个样品中目的基因的拷贝数和浓度。 此方法所用目的基因标准品的浓度是已知的，该标准品中目的基因的量可以被精确测定，因此可将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板来进行Real-time qPCR反应，以标准品中目的基因拷贝数的对数作为横坐标，以Ct值作为纵坐标，可绘制出一条标准曲线。 对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线方程中推算出样品中目的基因的拷贝数。 标准曲线以含有目的基因片段的重组质粒作为标准品，对标准品进行连续的10倍梯度稀释，得到一系列浓度相差十倍的样品，以此为模板进行Real time qPCR扩增，由每个样品的Ct值相对目的基因的拷贝数的对数绘制标准曲线。 合格的标准曲线的要求[1]： 标准曲线至少含有5以上的点； 标准曲线的扩增效率均在95%~105%之间； 相对系数R2值大于0.99； 融解曲线均为单一的峰。
含目的基因的标准品的构建过程即目的基因PCR产物克隆过程，大体步骤如下： 使用与Real-time qPCR相同的引物对目标基因片段进行PCR扩增； 切胶回收对扩增产物进行纯化； 使用合适的质粒载体对PCR产物进行克隆； 选择克隆成功的菌落通过PCR检测是否携带目的基因； 将检测成功的菌落加使用液体培养基进行扩大培养； 对培养后的菌体进行质粒提取，部分质粒测序验证其插入片段的序列是否与目的基因一致； 验证后的质粒应用核酸蛋白微量定量仪测定其浓度和纯度，保存于-20℃。目的基因克隆与质粒提取和浓度测定的详细过程见：PCR产物克隆基本过程、质粒提取和微量分光光度法测定核酸浓度。 标准品中目的基因拷贝数计算根据下面的公式计算标准质粒中目的基因的浓度[2]：
注1：DNA amount代表质粒的浓度，核酸蛋白微量定量仪测定的DNA浓度的单位一般为ng/μL，将其转换为g/μL得到的结果即为每μL标准质粒中目的基因的拷贝数。 注2：DNA length为质粒载体本身的长度与目的基因PCR产物长度之和。 [1] Zhang, X. X., Zhang, T., Zhang, M., et al., Characterization and quantification of class 1 integrons and associated gene cassettes in sewage treatment plants. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(6): 1169-1177. [2] Laing, D. W., Zhang, T., Fang, H. H. P., Real-time quantification of dominant anaerobes in an upflow reactor by polymerase chain reaction using a TaqMan probe. Water Science and Technology, 2008, 57(11): 1851-1855. |
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